Hypermethylierung von E-Cadherin und HIC-1 bei zwei prognostisch verschiedenen AML-Subgruppen

In der vorliegenden Arbeit wurde der Methylierungsstatus von zwei zytogenetisch definierten Formen der akuten myeloischen Leukämie verglichen. Es wurde DNA von sieben Patienten mit t(8;21), die der Niedrigrisikogruppe zugeteilt werden und acht Patienten mit Monosomie 5 bzw.7 oder del(5q) bzw. del(7q), die eine schlechtere Prognose besitzen und der Hochrisikogruppe angehören sowie die DNA von acht nicht an einer malignen Erkrankung leidenden Kontrollpersonen untersucht. Es sollte festgestellt werden, ob sich bestimmte prognostisch divergente AML-Subgruppen bezüglich der Methylierungsfrequenzen oder des Methylierungsphänotyps unterscheiden. Eine semiquantitative Abschätzung des Methylierungsstatus durch PCR-Produkt-Sequenzierung analog Melki et al. war für diesen Zweck jedoch nicht geeignet, so dass eine erheblich arbeits- und kostenintensivere Methode (Klonierung und automatische Sequenzierung) durchgeführt werden musste. Es konnte bei allen AML-Patienten eine signifikant höhere Methylierungsfrequenz als bei den Kontrollpersonen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass Methylierung im Sinne einer epigenetischen Alteration offenbar eine Relevanz bei der Entstehung der AML besitzt. Im Unterschied zur vorangehenden Aussage lässt eine Analyse der zytogenetischen Subgruppe jedoch keinen Unterschied in Bezug auf Topographie und Häufigkeit methylierter CpG-Dinukleotide erkennen. Anhand der untersuchten zwei Promotorregionen (E-Cadherin und HIC-1) kann also festgestellt werden, dass aberrante Methylierung bei AML eine häufige Begleiterscheinung ist, aber nach vorläufiger Erkenntnis keine Präferenz zu bestimmten zytogenetischen Risikokonstellationen aufweist. Weitere Untersuchungen zu dieser Frage wären erforderlich, um die pathogenetische Bedeutung von Promotormethylierung bei der AML einzuschätzen und darauf basierend mögliche therapeutische Substanzen, wie z.B. Demethylierungsagenzien für die Behandlung fortgeschrittener Leukämien zu entwickeln

Wirkung des Farnesyltransferaseinhibitors BZA-5B auf das Wachstum humaner Bronchialkarzinomzellen

Ras-Mutationen werden in zirka 30% aller malignen Tumoren nachgewiesen. Es sind drei verschiedene ras-Gene bekannt, nämlich H-, K- und N-ras. Am häufigsten wird eine Mutation des K-ras-Gens nachgewiesen, dieses macht beim Bronchialkarzinom mehr als 95% aller bekannten ras-Mutationen aus. Für die Funktion sowohl des onkogenen, als auch des normalen Ras-Proteins muss es nach mehreren Schritten posttranslationaler Modifikation zu einer Membranverankerung auf der Innenseite der Plasmamembran kommen. Einen zentralen Schritt hierzu stellt die Farnesylierung des Proteins durch das Enzym Farnesyltransferase dar. Farne-syltransferaseinhibitoren wie der Benzodiazepinabkömmling BZA-5B können diese Reaktion verhindern und somit die Membranverankerung unterbinden. Ras-Proteine sind an der Signaltransduktion von der Zellmembran zum Zellkern beteiligt, sie übermitteln in aktivem Zustand ein mitogenes Signal in das Zellinnere und wer-den dann wieder inaktiviert. Onkogen transformierte Ras-Proteine können nicht mehr inaktiviert werden, sie bleiben ständig in der aktiven Form und vermitteln ungebremstes malignes Wachstum. Verhindert man die Membranverankerung, kann es nicht zu einem Ras vermittelten, mitogenen Signal kommen. Wir untersuchten die Wirksamkeit des Farnesyltransferaseinhibitors BZA-5B auf die Unterbindung onkogener Ras-Wirkung in Mausfibroblasten und Zelllinien nichtkleinzelliger Bronchialkarzinome. Bei den Zelllinien mit nachgewiesener ras-Mutation zeigte sich in der Zellkultur ein Rückgang der Wachstumsgeschwindigkeit und eine Veränderung der Morphologie in Richtung nicht transformierter Zellen. Die Effekte waren nach vier Tagen trotz weiterer Anwesenheit des Inhibitors jedoch nicht mehr deutlich nachweisbar. Mit Hilfe des Einbaus radioaktiven Thymidins in die DNA (MTT-Test) konnte der inhibitorische Einfluss auf die Zellteilungsrate in ras-transformierten Zellen unter Einsatz von BZA-5B bestätigt werden, der jedoch ebenfalls nur 48 Stunden anhielt. Um den Zeitraum des Effektes des eingesetzten BZA-5B genauer einzugrenzen wurde die Inhibition ras-abhängiger Transkription über semiquantitative RT-PCR der Zielgene Cathepsin L, HUK und Keratin 8, 18 zu den Zeitpunkten Stunde null, 2, 4, 8, 12, 24 und 48 untersucht. Hier war nur ein zeitlich begrenzter Einfluss der eingesetzten Substanz von höchstens 24 Stunden nachweisbar. In der vorliegenden Arbeit konnte insgesamt die ras-spezifische, aber lediglich vorübergehend inhibierende Wirkung des Farnesyltransferaseinhibitors BZA-5B auf das maligne Wachstum nicht kleinzelliger Bronchialkarzinomzelllinien nachgewiesen werden. Die mit der Substanz BZA-5B erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass möglicherweise rasch einsetzende Resistenzmechanismen, etwa durch Aktivierung paralleler Signaltransduktionswege die ras-spezifische Wirkung einschränken. Aktuelle klinische Studien mit Farnesyltransferaseinhibitoren untersuchen deshalb die Wirkung von Kombinationstherapien mit konventionellen Zytostatika und mit Strahlentherapie. Die Therapie des fortgeschrittenen nicht kleinzelligen Bronchialkarzinoms durch neue Behandlungskonzepte zu verbessern ist Ziel verschiedener klinischer Studien. Der Einsatz von Farnesyltransferaseinhibitoren kann sicherlich in Zukunft zu einem derartigen Konzept gehören

Diagnostische Bedeutung von Telomerase-Aktivität in Perikardergüssen

Die Erkennung von malignen Zellen in Perikardergüssen ist ein bleibendes Problem in der klinischen Diagnostik. Als Goldstandard für die Detektion von Tumorzellen in Ergüssen gilt zur Zeit die Zytologie. Trotzdem werden bei dieser Untersuchung regelmäßig maligne Zellen übersehen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den Nutzen der Telomerase-Aktivitätsmessung für die Begutachtung von Perikardergüssen herauszufinden, um möglicherweise neben der Zytologie ein weiteres Entscheidungskriterium zur Beurteilung der Malignität von Ergüssen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden 31 zytologisch kontrollierte Perikardergüsse auf erhöhte Telomerase-Aktivität mit Hilfe eines konventionellen und eines fluoreszenz-basierten sog. TRAP-Assays (Telomeric Repeat Amplification Protocol) untersucht. Die Ergebnisse des konventionellen TRAP-Assays zeigen eine hohe Korrelation zwischen dem Telomerase-Aktivitätsnachweis und dem zytopathologisch bestätigten Nachweis von malignen Zellen: es konnte eine Sensitivität von 100 % bei einer Spezifität von 91,7 % erreicht werden. Da niedrige Telomerase-Aktivität auch in Stammzellen oder aktivierten Entzündungszellen vorkommt und möglicherweise falsch-positive Ergebnisse provoziert, wurde im weiteren Verlauf der Arbeit versucht, die Aktivität dieses Enzyms zu quantifizieren. Durch die Quantifizierung sollten Rückschlüsse über die Herkunft der Telomerase-Aktivität gewonnen werden. Dazu wurde der fluoreszenz-basierte F-TRAP-Assay etabliert und anhand eines Standards einer telomerase-positiven kleinzelligen Bronchialkarzinomlinie (NCI-H69) kalibriert. Bei den Versuchen wurden nur geringfügige Mess-Schwankungen der Telomerase-Aktivität innerhalb der Verdünnungsreihen registriert. Dies bedeutet eine wenn auch eingeschränkte Quantifizierbarkeit der Telomerase-Aktivität. Daher wurden weitere Untersuchungen vorgenommen, um die Ursache für diese Abweichungen zu ermitteln. Es stellte sich heraus, dass die Schwankungen durch die Elongation und nicht durch die PCR-Amplifikation verursacht werden. Die Elongationsphase stellt damit das Kernproblem bei der Quantifizierung von Telomerase-Aktivität dar. Des Weiteren wurde die Hintergrundaktivität im Perikarderguss anhand von CD34+-Zellen und peripheren mononukleären Zellen aus peripherem Blut überprüft. Diese Untersuchung erfolgte zu dem Zweck, die mögliche Kontamination eines Perikardergusses durch proliferierende Entzündungszellen zu simulieren und gleichzeitig einen „Cut-off“-Wert für Hintergrundaktivität zu generieren. In beiden Zellarten wurde lediglich ein niedriger Level an Telomerase-Aktivität registriert. Aufgrund der Diskrepanz zwischen den Aktivitätsspiegeln benigner Entzündungszellen im Vergleich zu malignen Tumorzellen konnten Rückschlüsse auf die Herkunft der Telomerase-Aktivität gewonnen werden. Obwohl eine absolute Quantifizierung von Telomerase-Aktivität nicht möglich war, konnte durch die Einführung des „Cut-off“-Wertes die Spezifität durch den F-TRAP-Assay auf 95,8 % gesteigert werden ohne einen Verlust an Sensitivität hinnehmen zu müssen. Die hohe Sensitivität beider Assays weist auf die besondere Eignung von Perikardzytomaterial für Telomerase-Aktivitätsmessungen hin. Hierzu hat möglicherweise auch eine gute Qualität der verwendeten Proteinextrakte mit einem vermutlich geringen Anteil an Proteinasen und RNAsen beigetragen. Die Ergebnisse beider TRAP-Assays zeigen, dass die Bestimmung der Telomerase-Aktivität ein reliabler Indikator für das Vorhandensein von Tumorzellen in Perikardergüssen ist und damit eine sinnvolle Ergänzung zur zytologischen Untersuchung darstellt. Insbesondere in Zweifelsfällen könnte die Telomerase-Aktivitätsmessung aufschlussreiche Zusatzinformationen bieten. Die Untersuchung wird derzeit aufgrund des methodischen Aufwands jedoch noch Speziallabors vorbehalten sein

Expression von Differenzierungsmarkern in kombinierten kleinzelligen Bronchialkarzinomen

Bronchialkarzinome stellen eine Gruppe heterogen differenzierter Tumoren dar. Insbesondere die Untergruppe der kleinzelligen Karzinome ist aufgrund der Entwicklung sekundärer Resistenz im Rahmen der Behandlung durch Chemotherapie mit dem Stigma einer inkurablen Erkrankung behaftet. Die Resistenz korreliert mit dem Nachweis varianter Zellen in histopathologischen Untersuchungen, die einen Verlust ihrer neuroendokrinen Differenzierung erlitten haben. Ausgangspunkt unserer Untersuchungen, die auf die Entwicklung eines in-vitro-Modells, das die Pathogenese varianter Tumoren in vivo erklären könnte, abzielten, war die Beobachtung einer spontanen Transdifferenzierung dreier klassisch kleinzelliger Bronchialkarzinomlinien von der typischen Suspensionsform in einen adhärenten Typ. Die morphologische Transdifferenzierung führte in den betreffenden Linien zu einer Konformationsänderung der Zellen in einen eher epithelialen Typ. Durch die detaillierte Charakterisierung dieser Varianten auf sowohl Gen- als auch Proteinebene stets im Vergleich mit den Ursprungslinien ließen sich die „Begleiterscheinungen“ des Transdifferenzierungsprozesses aufzeigen: Es resultierte ein Verlust verschiedener neuroendokriner Markergene (L-Dopa-Decarboxylase, Chromogranin A, Synaptophysin etc). Konsekutiv kam es in den adhärenten Linien zu einem Zugewinn von ansonsten in Nichtkleinzellern vertretenen Genprodukten (CD44, Integrine, Thrombospondin). Des Weiteren wurde die prinzipielle Reversibilität dieses Transdifferenzierungsprozesses überprüft, indem in einem zeitlich definierten Zwei-Punkt-Experiment die Adhärenz aufgehoben wurde. Es konnte eine teils ausgeprägte, teils unvollständige oder noch in Anfängen befindliche Rückdifferenzierung der adhärenten Zellen in Richtung Suspensionszelle beobachtet werden. Am deutlichsten trat dieser Effekt in der Linie N592 zutage, die sich durch ausgeprägte Adhärenz auszeichnete. Zu zeigen war ein Anstieg der Expression für L-Dopa-Decarboxylase und ein leichtes Absinken der CD44-Expression. Integrin β1 sank in etwas stärkerem Maße ab. Auch in den beiden anderen Linien fanden sich Ansätze einer zumindest partiellen Rückdifferenzierung. Im letzten Schritt wurde der Versuch unternommen, die Erkenntnisse des zuvor postulierten Zellkulturmodells auf Mischtumoren von Bronchialkarzinomen zu übertragen. Dazu wurden immunhistochemische Färbungen für den bewährten Differenzierungsmarker CD44 an paraffin-konservierten Lungenturmoren durchgeführt. Es zeigte sich eine dem in-vitro-Modell ähnliche Verteilung des Oberflächenrezeptors innerhalb der Untergruppen der Bronchialkarzinome: Sämtliche klassische kleinzellige Tumoren waren negativ für diesen Oberflächenrezeptor, wohingegen 65,5% aller NSCLC eine CD44-Immunoreaktivität aufwiesen. Für eine kleine Auswahl echter kombinierter (varianter) Kleinzeller konnte ein differentielles CD44-Verteilungsmuster innerhalb desselben Präparates gefunden werden. So färbte sich ausschließlich der jeweils enthaltene nichtkleinzellige Tumoranteil an, während der Kleinzeller selbst negativ war. Dies galt ebenso für die zwei heterogen differenzierten Tumoren, die als zusätzliche Komponente lediglich plattenepitheliale Metaplasien als potentielles Vorläuferstadium eines invasiven Karzinoms enthielten. Diese Arbeit hat dazu beigetragen, den Prozess der spontanen Variantenentstehung unter in-vitro-Bedingungen gezielt zu charakterisieren und detailliert die Veränderungen in den Linien zu beschreiben. Die vorliegenden Ergebnisse können in Zusammenschau mit in der Arbeitsgruppe vorgenommenen Untersuchungen zur erhöhten Chemoradioresistenz und zur verstärkten Aktivität von Apoptoseinhibitoren dazu helfen, ein Modell für die Entstehung varianter Kleinzeller in vitro zu beschreiben. Die Übertragbarkeit dieses Erklärungsmodells für die Pathogenese varianter Tumoren in vivo scheint aufgrund erster immunhistochemischer Daten für CD44 möglich, ist allerdings durch diese Resultate nicht ausreichend zu bestätigen. Insbesondere im Hinblick auf einen therapeutischen Nutzen für die betroffenen Patienten wäre die Ausweitung von Zellkulturexperimenten auf weitere kleinzellige Linien und die Suche nach geeigneten Differenzierungsmarkern für Untersuchungen an soliden Tumoren wünschenswert, um das Verständnis für die Besonderheiten der varianten kleinzelligen Bronchialkarzinome zu vertiefen und damit letztlich die Behandlungsstragien zu optimieren